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真核有參轉錄組

產品介紹

轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有mRNA。轉錄組測序能夠從整體水平研究基因表達量以及基因結構,揭示特定生物學過程中的分子機理;目前已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷、藥物研發和分子育種等領域。

結果展示

數據質控

為確保Reads有足夠高的質量,將下機原始測序數據(raw reads)去掉含有帶接頭的、低質量的reads,得到clean reads,保證后續分析的準確性。測序因受測序儀本身、測序試劑、樣品等因素影響,存在一定的錯誤率。堿基測序錯誤率分布圖可以反映測序數據的質量。

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參考序列比對

將Clean Reads與參考基因組進行序列比對,獲取在參考基因組或基因上的位置信息,定位區域分為Exon(外顯子)、Intron(內含子)
和Intergenic(基因間區)。比對到參考基因組上的Reads稱為Mapped Reads,Mapped Reads占Clean Reads的百分比,可以評估所選參考基因組組裝是否能滿足信息分析的需求。

基因表達水平分析

生物學重復的相關性不僅可以檢驗生物學實驗操作的可重復性,還可以評估差異表達基因的可靠性和輔助異常樣品的篩查。

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重復相關性評估

生物學重復的相關性不僅可以檢驗生物學實驗操作的可重復性,還可以評估差異表達基因的可靠性和輔助異常樣品的篩查。

差異表達基因分析

差異表達基因以火山圖、MA圖、韋恩圖、聚類熱圖、蛋白互作圖等形式呈現,通過火山圖(Volcano Plot)可以快速地查看基因在兩個(組)樣品中表達水平的差異,以及差異的統計學顯著性。對于有生物學重復的樣本,我們采用DEseq進行樣品組間的差異表達分析,獲得兩個生物學條件之間的差異表達基因集;對于沒有生物學重復的樣本,使用EBseq進行差異分析。篩選差異基因標準一般為:Fold Change≥2,FDR<0.01。

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差異表達基因聚類分析

聚類分析用于判斷差異基因在不同實驗條件下的表達模式,可通過將表達模式相同或相近的基因聚集成類,從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能,同類基因可能具有相似的功能或共同參與同一代謝過程。

差異表達基因GO分類

差異表達基因GO注釋分類統計圖,直觀的反映出在生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)
和分子功能(molecular function),所有基因和差異基因注釋GO term的個數分布。可深入挖掘差異基因的功能及所在的信號通路,篩選關注差異基因注釋情況。

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差異表達基因蛋白互作網絡

STRING收錄多個物種預測的和實驗驗證的蛋白質-蛋白質互作的數據庫,包括直接的物理互作和間接的功能相關。結合差異表達分析結果和數據庫收錄的互作關系對,構建差異表達基因互作網絡。

常見問題

Q1. 在轉錄組的三個重復測序中,不是所有基因的的可變剪接都會出現3次,有的出現1次或2次,這種情況如何判定該基因是否存在相應的剪接方式?

答:針對每個樣品,同一個基因的不同轉錄本會存在可變剪接,我們只是根據測序的實際數據對可變剪接進行預測,而不是進行驗證;如果要判斷是否存在相應的剪接方式,需要實驗去驗證。重復實驗存在一定的差異,會導致可變剪接的不同。

Q2. 轉錄組結果與基因組比對后,沒有相應的注釋結果,我們認為是New genes。但是,在NCBI注釋后,有些基因的注釋結果顯示是參考基因組物種,這種基因還能算是new genes嗎?

答:我們分析流程中是將測序的Reads比對到參考基因組,然后進行拼接,其中一些reads比對到基因間區并且能拼接出完整的開放閱讀框,拼接出來的位于基因間區的這些基因即為新基因。預測得到的新基因才會進行功能注釋,所以注釋結果與新基因的判斷沒有關系。

Q3:生物學重復樣品中某個樣品與其他相關性不太好該怎么處理?會不會影響文章發表?

答:為了確保分析結果的準確性,老師通常會設置3個生物學重復,這樣就可能出現生物學重復中某個樣品相關性不好的情況,影響后續差異分析結果的準確性。通常可將該處理組中相關性不好的樣品剔除,再進行差異分析。后期可通過RT-qPCR等試驗手段彌補生物學重復的不足,不會影響文章的發表。

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